Vejen til behandling 23
Interview med Tom Schwarz fra Harvard
Vi var i kontakt med Thomas Schwarz, som er professor i neurobiologi ved Harvard Medical School og professor i neurologi ved FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital. Thomas Schwarz og hans laboratorium er involveret i ADOA-forskning og udvikler ikke én, men to potentielle behandlinger!
Kan du give os et indblik i, hvordan du forsker i ADOA?
Jeg vil svare ved at forklare, hvad teamet på Boston Children's Hospital har gjort vedrørende ADOA, og hvad vi forsøger at gøre ved at udvikle terapeutiske retninger. Vores arbejde med ADOA voksede ud af samtaler med en familie, der havde en meget personlig interesse i denne sygdom og var ivrig efter at fremme og endda sponsorere forskning i ADOA. Her på Boston Children's Hospital er der et meget stærkt grundlæggende neurovidenskabsfællesskab, herunder adskillige videnskabsmænd, der studerer retinale ganglieceller, den celletype, der er mest tilbøjelig til at degenerere i ADOA. Og der er også mit laboratorium, som længe har været interesseret i neurale mitokondriers cellebiologi. Dette inkluderer mitokondrierne i retinale ganglieceller, som dør på grund af ADOA. Vi sammensatte derfor et samarbejdskonsortium, der omfattede mit laboratorium og Drs. Michael Do, Larry Benowitz og Chinfei Chen. Vi har også et fremragende løbende samarbejde med Dr. Marni Falk og hendes kolleger på Children's Hospital of Philadelphia (CHoP). Jeg må sige, at det meste af arbejdet blev udført af en fantastisk postdoc i mit laboratorium, Dr. Chen Ding, PhD, med hjælp og vejledning fra vores kolleger og kernefaciliteter her på Boston Children's.
Vores plan var at skabe en ny musemodel af ADOA, der bar R290Q-mutationen fundet i flere familier. Mange ADOA-mutationer forårsager, hvad genetikere kalder "haploinsufficiens", hvilket betyder, at mutationen simpelthen forhindrer en af de to kopier af OPA1-genet i at lave et funktionelt protein, og cellerne må nøjes med halvdelen af den mængde OPA1, som de normalt burde have. . Andre ADOA-mutationer – især dem, der falder i den del af OPA1 med enzymatisk aktivitet – er værre end blot at lave et protein, der ikke fungerer. I stedet laver de et protein, der aktivt kommer i vejen og forhindrer den gode kopi af OPA1 i også at fungere. Disse kaldes "dominant negative" mutationer, og patienter med disse mutationer kaldes nogle gange ADOA+ patienter. R290Q-mutationen sidder lige ved kanten af denne enzymatiske del, så vi vidste ikke, om det ville være en simpel mutation med tab af funktion eller en dominerende negativ, men vi håbede, at den ville give en stærk nok fænotype i musen, der vi kunne bruge det til at studere degenerationen af retinale ganglieceller.
Hvordan lykkedes det dig at ændre musens gener, hvilken teknologi brugte du?
Vi brugte CRISPR-teknologi til at introducere denne R290Q-mutation – hvilket viste sig at være overraskende svært! Vi tror, det skyldes, at CRISPR-metoden fungerede for godt og muterede begge kopier af OPA1-genet - og celler med begge kopier muterede vil ikke producere en levedygtig mus. Men til sidst lykkedes det os at skabe R290Q mutant muselinjen og har studeret den mus i de sidste 2 år. Vi fik også fra CHoP en stamcellelinje, der kommer fra en patient og har samme mutation - og en kontrolgruppe med den mutation korrigeret af CRISPR. Det betyder, at vi kan udføre eksperimenter parallelt i musemodellen og i menneskelige neuroner, som vi kan generere fra disse stamceller. Arbejdet med R290Q-musen går godt. OPA1-genets normale funktioner omfatter at tillade mitokondriers indre membraner at fusionere, når to mitokondrier mødes. I raske celler, herunder sunde neuroner, er mange mitokondrier smeltet sammen til et netværk. I neuroner fra R290Q-musen er mitokondrierne dog fragmenteret, som forventet med en OPA1-mutation. Nethinderne hos disse mus er overraskende normale og funktionelle, når musene er unge, men efterhånden som de bliver ældre, ser vi mange defekter, der er parallelle med dem, der ses hos ADOA-patienter. Husk, at tabet af retinale ganglieceller hos ADOA-patienter kan tage årtier, men mus lever typisk i omkring 2 år. Så vi er heldige, at vi i vores musemodel kan se, at nogle af disse retinale ganglieceller dør efter kun 9-12 måneder.
Hos raske mus er der et normalt isolerende lag omkring axonerne (den lange del af synsnerven, der overfører information til hjernen) i retinale ganglieceller. R290Q-musen viser også demyelinisering af nervefibre (axoner) i synsnerven – med andre ord et tab af det normale isoleringslag, der hjælper med nerveledning i den del af nethindens ganglieceller, der fører signaler fra øjet til hjernen . Vi laver også elektrofysiologiske optagelser (elektroretinogrammer og visual evoked potentials), der kan detektere retinale gangliecellers evne til at affyre og sende signaler til hjernen. Disse optagelser viser dybe defekter, efterhånden som dyrene ældes. Derudover har Michael Dos laboratorium etableret et bemærkelsesværdigt assay, hvor de kan skære nethinden ud med synsnerven fastgjort til den, præsentere præcise lysmønstre til nethinden og registrere den resulterende elektriske aktivitet i synsnerven – en smuk direkte måde at undersøge funktionen af populationer af retinale ganglieceller. Dette antyder igen en ændring i funktion i R290Q-mutantmusen og begynder at afsløre, hvor denne ændring finder sted.
Kan du fortælle os lidt mere om, hvordan dette kan føre til en behandling for ADOA?
Med vores modelsystemer ved hånden tester vi to terapeutiske strategier. En af dem er generstatningsterapi. Kort sagt er dette en måde at sætte en god kopi af OPA1 tilbage i retinale ganglieceller. På den ene side er ADOA en god kandidat til denne tilgang, fordi det er relativt nemt at få kopier af et gen ind i retinale ganglieceller ved injektion i øjets glaslegeme med en sikker, ikke-reproducerende virus, der udtrykker genet . Dette er en form for genterapi godkendt til klinisk brug i nethinden til andre tilstande. Fordi degenerationen er langsom, er der desuden et godt tidsvindue til at forsøge at forstyrre degenerationen ved at tilføje det gode eksemplar. Men der er et problem – det humane OPA1-protein er lavet i 8 forskellige varianter (ved en proces kaldet alternativ RNA-splejsning), og det er ikke muligt at tilføje dem alle tilbage. Vi er ved at finde ud af, om det er nok at tilføje én af disse varianter, og i så fald hvilken variant vi skal bruge.
Vores anden tilgang er at hæmme et neuronalt protein kaldet SARM1. SARM1 er et enzym, der aktiveres i stressede eller beskadigede neuroner og får neuroner til at dø - det ser ud til ikke at have noget andet formål end at tjene som en celle selvmordsomskifter. Mange mennesker i den akademiske verden og i medicinal- og biotekvirksomheder investerer tid og penge i at udvikle SARM1-hæmning som en strategi til at forhindre neurodegeneration. Hvis degenerationen af retinale ganglionceller i ADOA fortsætter ved at aktivere SARM1, kan ADOA-patienter drage fordel af denne udvikling.
Forventer du, at behandlingen under udvikling er anvendelig til en bredere gruppe af ADOA-patienter, eller vil den være mutationsspecifik?
I modsætning til nogle CRISPR-baserede strategier, der kun er rettet mod én specifik mutation, bør både gendannelse af en arbejdskopi af OPA1 og forebyggelse af SARM1-aktivering fungere lige godt for de fleste, måske alle, patienter, der har OPA1-mutationer. Undtagelsen fra generstatningstilgangen kan være i de alvorlige dominerende negative former, der findes i ADOA+; der ville være en form for konkurrence mellem de muterede kopier og de normale kopier, og den dominerende negative mutation kunne stadig forårsage problemer. Den anden advarsel er, at disse strategier, hvis de virker, ville være relativt nemme at anvende i øjet, men genterapi er sværere for de andre typer neuroner, der er påvirket i ADOA+.
Kunne de to terapeutiske tilgange bruges i kombination, eller ville fokus være på det ene eller det andet?
Vi håber, at mindst én af disse strategier vil betale sig. Hvis de begge virker, ser jeg ingen grund til, at strategierne, hvis de virker, ikke kunne kombineres, hvis det ville øge deres effektivitet. Der er intet a priori uforeneligt ved dem.
Til sidst vil jeg gerne understrege, hvor afgørende det har været at have et team af eksperter. Det er manges styrke – ingen af os ville have haft modet til at tage denne udfordring op uden vores samlede ekspertise, og intet af det ville være sket uden initiativet fra familien, der gav næring til og støttede projektet.
