La strada verso la cura 23
Intervista con Tom Schwarz di Harvard
Eravamo in contatto con Thomas Schwarz, professore di Neurobiologia alla Harvard Medical School e Professore di Neurologia al FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital. Thomas Schwarz e il suo laboratorio sono coinvolti nella ricerca dell'ADOA e stanno sviluppando non uno, ma due potenziali trattamenti!
Puoi darci qualche informazione su come effettui ricerche su ADOA?
Risponderò spiegando cosa ha fatto l'équipe del Boston Children's Hospital riguardo all'ADOA e cosa stiamo cercando di fare sviluppando indicazioni terapeutiche. Il nostro lavoro sull'ADOA è nato da conversazioni con una famiglia che aveva un interesse molto personale per questa malattia ed era desiderosa di promuovere e persino sponsorizzare la ricerca sull'ADOA. Qui al Boston Children's Hospital c'è una comunità neuroscientifica di base molto forte, tra cui diversi scienziati che studiano le cellule gangliari della retina, il tipo di cellula più incline alla degenerazione nell'ADOA. E c'è anche il mio laboratorio, che da tempo si interessa alla biologia cellulare dei mitocondri neurali. Ciò include i mitocondri nelle cellule gangliari della retina, che muoiono a causa dell'ADOA. Abbiamo quindi messo insieme un consorzio di collaborazione che comprendeva il mio laboratorio e quello dei Drs. Michael Do, Larry Benowitz e Chinfei Chen. Abbiamo anche un’eccellente collaborazione continuativa con il Dr. Marni Falk e i suoi colleghi del Children's Hospital di Philadelphia (CHoP). Devo dire che la maggior parte del lavoro è stato svolto da un fantastico postdoc nel mio laboratorio, il Dr. Chen Ding, PhD, con l'aiuto e la guida dei nostri colleghi e delle strutture principali qui al Boston Children's.
Il nostro piano era quello di creare un nuovo modello murino di ADOA portatore della mutazione R290Q riscontrata in diverse famiglie. Molte mutazioni ADOA causano ciò che i genetisti chiamano “aploinsufficienza”, il che significa che la mutazione impedisce semplicemente a una delle due copie del gene OPA1 di produrre una proteina funzionale e le cellule devono accontentarsi della metà della quantità di OPA1 che dovrebbero normalmente avere. . Altre mutazioni dell'ADOA – soprattutto quelle che rientrano nella parte di OPA1 con attività enzimatica – sono peggiori della semplice produzione di una proteina che non funziona. Invece, producono una proteina che interferisce attivamente e impedisce anche il funzionamento della copia buona di OPA1. Queste sono chiamate mutazioni “dominanti negative” e i pazienti con queste mutazioni sono talvolta chiamati pazienti ADOA+. La mutazione R290Q si trova proprio al limite di questa parte enzimatica, quindi non sapevamo se sarebbe stata una semplice mutazione con perdita di funzione o una dominante negativa, ma speravamo che avrebbe dato un fenotipo abbastanza forte nel topo da potremmo usarlo per studiare la degenerazione delle cellule gangliari della retina.
Come sei riuscito a modificare i geni del topo, quale tecnologia hai utilizzato?
Abbiamo utilizzato la tecnologia CRISPR per introdurre questa mutazione R290Q, cosa che si è rivelata sorprendentemente difficile! Riteniamo che ciò sia dovuto al fatto che il metodo CRISPR ha funzionato troppo bene e ha mutato entrambe le copie del gene OPA1 – e le cellule con entrambe le copie mutate non produrranno un topo vitale. Ma alla fine siamo riusciti a creare la linea di topi mutanti R290Q e abbiamo studiato quel topo negli ultimi 2 anni. Abbiamo anche ottenuto da CHoP una linea di cellule staminali che proviene da un paziente e presenta la stessa mutazione – e un gruppo di controllo con quella mutazione corretta da CRISPR. Ciò significa che possiamo eseguire esperimenti in parallelo nel modello murino e nei neuroni umani che possiamo generare da quelle cellule staminali. Il lavoro con il mouse R290Q sta andando bene. Le normali funzioni del gene OPA1 includono la possibilità di fondere le membrane interne dei mitocondri quando due mitocondri si incontrano. Nelle cellule sane, compresi i neuroni sani, molti mitocondri sono fusi insieme in una rete. Tuttavia, nei neuroni del topo R290Q, i mitocondri sono frammentati, come previsto con una mutazione OPA1. Le retine di questi topi sono sorprendentemente normali e funzionali quando i topi sono giovani, ma man mano che invecchiano vediamo molti difetti paralleli a quelli osservati nei pazienti ADOA. Ricordare che la perdita delle cellule gangliari della retina nei pazienti ADOA può richiedere decenni, ma i topi in genere vivono circa 2 anni. Quindi siamo fortunati che nel nostro modello murino possiamo vedere che alcune di quelle cellule gangliari della retina muoiono dopo soli 9 – 12 mesi.
Nei topi sani, attorno agli assoni (la parte lunga del nervo ottico che trasmette informazioni al cervello) delle cellule gangliari della retina è presente un normale strato isolante. Il topo R290Q mostra anche una demielinizzazione delle fibre nervose (assoni) nel nervo ottico – in altre parole, una perdita del normale strato isolante che aiuta la conduzione nervosa nella parte delle cellule gangliari della retina che trasporta i segnali dall'occhio al cervello . Effettuiamo anche registrazioni elettrofisiologiche (elettroretinogrammi e potenziali evocati visivi) in grado di rilevare la capacità delle cellule gangliari retiniche di attivarsi e inviare segnali al cervello. Queste registrazioni mostrano profondi difetti man mano che gli animali invecchiano. Inoltre, il laboratorio di Michael Do ha messo a punto un'analisi straordinaria in cui possono ritagliare la retina con il nervo ottico attaccato ad essa, presentare schemi luminosi precisi alla retina e registrare l'attività elettrica risultante nel nervo ottico - un modo meravigliosamente diretto studiare la funzione delle popolazioni di cellule gangliari della retina. Ciò suggerisce ancora una volta un cambiamento nella funzione nel topo mutante R290Q e inizia a rivelare dove si verifica tale cambiamento.
Puoi dirci qualcosa di più su come questo potrebbe portare a una terapia per l'ADOA?
Con i nostri sistemi modello a portata di mano, testiamo due strategie terapeutiche. Uno di questi è la terapia di sostituzione genica. In poche parole, questo è un modo per reinserire una buona copia di OPA1 nelle cellule gangliari della retina. Da un lato, ADOA è un buon candidato per questo approccio perché è relativamente facile ottenere copie di un gene nelle cellule gangliari della retina mediante iniezione nell’umor vitreo dell’occhio, con un virus sicuro e non riproduttivo che esprime il gene . Questa è una forma di terapia genica approvata per uso clinico nella retina per altre condizioni. Inoltre, poiché la degenerazione è lenta, esiste una buona finestra temporale per cercare di interrompere la degenerazione aggiungendo il campione buono. Ma c'è un problema: la proteina umana OPA1 è prodotta in 8 diverse varianti (mediante un processo chiamato splicing alternativo dell'RNA) e non è possibile aggiungerle tutte. Stiamo valutando se aggiungere solo una di queste varianti sarà sufficiente e, in tal caso, quale variante utilizzare.
Il nostro secondo approccio consiste nell’inibire una proteina neuronale chiamata SARM1. SARM1 è un enzima che viene attivato nei neuroni stressati o danneggiati e provoca la morte dei neuroni: sembra non avere altro scopo se non quello di fungere da interruttore suicida cellulare. Molte persone nel mondo accademico e nelle aziende farmaceutiche e biotecnologiche stanno investendo tempo e denaro nello sviluppo dell’inibizione della SARM1 come strategia per prevenire la neurodegenerazione. Se la degenerazione delle cellule gangliari della retina nell’ADOA procede attivando la SARM1, i pazienti ADOA potrebbero trarre beneficio da questi sviluppi.
Vi aspettate che il trattamento in sviluppo sia applicabile a un gruppo più ampio di pazienti ADOA o sarà specifico per la mutazione?
A differenza di alcune strategie basate su CRISPR che prendono di mira solo una mutazione specifica, sia il ripristino di una copia funzionante di OPA1 che la prevenzione dell’attivazione di SARM1 dovrebbero funzionare altrettanto bene per la maggior parte, forse tutti, i pazienti che presentano mutazioni OPA1. L'eccezione all'approccio di sostituzione genica potrebbe essere rappresentata dalle gravi forme dominanti negative riscontrate in ADOA+; ci sarebbe una sorta di competizione tra le copie mutate e le copie normali e la mutazione negativa dominante potrebbe ancora causare problemi. L’altro avvertimento è che queste strategie, se funzionassero, sarebbero relativamente facili da applicare nell’occhio, ma la terapia genica è più difficile per gli altri tipi di neuroni colpiti nell’ADOA+.
I due approcci terapeutici potrebbero essere usati in combinazione o l’attenzione si concentrerebbe sull’uno o sull’altro?
Ci auguriamo che almeno una di queste strategie possa dare i suoi frutti. Se funzionano entrambi, non vedo motivo per cui le strategie, se funzionano, non potrebbero essere combinate se ciò ne aumentasse l’efficacia. Non c’è nulla di incompatibile a priori in loro.
Vorrei infine sottolineare quanto sia stato fondamentale disporre di un team di collaboratori esperti. Questa è la forza di molti: nessuno di noi avrebbe avuto il coraggio di affrontare questa sfida senza la nostra esperienza combinata e niente di tutto ciò sarebbe accaduto senza l’iniziativa della famiglia che ha alimentato e sostenuto il progetto.
