Droga do leczenia 23
Wywiad z Tomem Schwarzem z Harvardu
Skontaktowaliśmy się z Thomasem Schwarzem, profesorem neurobiologii w Harvard Medical School i profesorem neurologii w Centrum Neurobiologii FM Kirby w Bostońskim Szpitalu Dziecięcym. Thomas Schwarz i jego laboratorium są zaangażowani w badania nad ADOA i opracowują nie jedną, ale dwie potencjalne metody leczenia!
Czy możesz nam opowiedzieć o tym, jak badasz ADOA?
Odpowiem, wyjaśniając, co zespół Bostońskiego Szpitala Dziecięcego zrobił w sprawie ADOA i co staramy się osiągnąć, opracowując kierunki terapeutyczne. Nasza praca nad ADOA wyrosła z rozmów z rodziną, która bardzo osobiście interesowała się tą chorobą i chciała promować, a nawet sponsorować badania nad ADOA. W Bostońskim Szpitalu Dziecięcym pracuje bardzo silna społeczność zajmująca się podstawową neuronauką, w tym kilku naukowców badających komórki zwojowe siatkówki, typ komórek najbardziej podatny na zwyrodnienie w ADOA. Jest też moje laboratorium, które od dawna interesuje się biologią komórki mitochondriów nerwowych. Obejmuje to mitochondria w komórkach zwojowych siatkówki, które umierają z powodu ADOA. Dlatego utworzyliśmy wspólne konsorcjum, w skład którego wchodziło moje laboratorium i laboratorium dr. Michaela Do, Larry’ego Benowitza i Chinfei Chena. Mamy także doskonałą, stałą współpracę z dr. Marni Falk i jej koledzy ze Szpitala Dziecięcego w Filadelfii (CHOP). Muszę powiedzieć, że większość pracy wykonał w moim laboratorium fantastyczny postdoc, dr. Doktor Chen Ding, z pomocą i wskazówkami naszych kolegów i podstawowych placówek w Boston Children's.
Nasz plan polegał na stworzeniu nowego mysiego modelu ADOA, który będzie nosił mutację R290Q występującą w kilku rodzinach. Wiele mutacji ADOA powoduje to, co genetycy nazywają „haploinsufficiency”, co oznacza, że mutacja po prostu uniemożliwia jednej z dwóch kopii genu OPA1 wytworzenie funkcjonalnego białka, a komórki muszą zadowolić się połową ilości OPA1, którą normalnie powinny mieć . Inne mutacje ADOA – zwłaszcza te, które należą do części OPA1 o aktywności enzymatycznej – są gorsze niż samo wytwarzanie białka, które nie działa. Zamiast tego wytwarzają białko, które aktywnie przeszkadza i uniemożliwia funkcjonowanie dobrej kopii OPA1. Nazywa się je mutacjami „dominującymi negatywnymi”, a pacjentów z tymi mutacjami nazywa się czasami pacjentami ADOA+. Mutacja R290Q znajduje się tuż na skraju tej części enzymatycznej, więc nie wiedzieliśmy, czy będzie to zwykła mutacja powodująca utratę funkcji, czy dominująca mutacja negatywna, ale mieliśmy nadzieję, że zapewni myszowi wystarczająco silny fenotyp, który moglibyśmy go użyć do badania zwyrodnienia komórek zwojowych siatkówki.
Jak udało Ci się zmienić geny myszy, jakiej technologii użyłeś?
Do wprowadzenia tej mutacji R290Q wykorzystaliśmy technologię CRISPR – co okazało się zaskakująco trudne! Uważamy, że dzieje się tak dlatego, że metoda CRISPR zadziałała zbyt dobrze i spowodowała zmutowanie obu kopii genu OPA1, a komórki, w których zmutowano obie kopie, nie dadzą zdolnej do życia myszy. Ale w końcu udało nam się stworzyć linię myszy z mutacją R290Q i badaliśmy tę mysz przez ostatnie 2 lata. Otrzymaliśmy również od CHoP linię komórek macierzystych pochodzącą od pacjenta i mającą tę samą mutację – oraz grupę kontrolną z tą mutacją skorygowaną za pomocą CRISPR. Oznacza to, że możemy przeprowadzać eksperymenty równolegle na modelu mysim i na ludzkich neuronach, które możemy wygenerować z tych komórek macierzystych. Praca z myszką R290Q przebiega pomyślnie. Normalne funkcje genu OPA1 obejmują umożliwianie fuzji wewnętrznych błon mitochondriów, gdy spotykają się dwa mitochondria. W zdrowych komórkach, w tym w zdrowych neuronach, wiele mitochondriów jest połączonych w sieć. Jednakże w neuronach myszy R290Q mitochondria są pofragmentowane, zgodnie z oczekiwaniami w przypadku mutacji OPA1. Siatkówki tych myszy są zaskakująco normalne i funkcjonalne, gdy myszy są młode, ale wraz z wiekiem widzimy wiele defektów podobnych do tych obserwowanych u pacjentów z ADOA. Należy pamiętać, że utrata komórek zwojowych siatkówki u pacjentów z ADOA może zająć dziesięciolecia, ale myszy zazwyczaj żyją około 2 lat. Mamy więc szczęście, że w naszym mysim modelu widzimy, że niektóre komórki zwojowe siatkówki umierają już po 9–12 miesiącach.
U zdrowych myszy wokół aksonów (długiej części nerwu wzrokowego przekazującej informacje do mózgu) komórek zwojowych siatkówki znajduje się normalna warstwa izolacyjna. Mysz R290Q wykazuje również demielinizację włókien nerwowych (aksonów) nerwu wzrokowego – innymi słowy utratę normalnej warstwy izolacyjnej, która pomaga w przewodzeniu nerwowym w części komórek zwojowych siatkówki, która przenosi sygnały z oka do mózgu . Wykonujemy również zapisy elektrofizjologiczne (elektroretinogramy i wzrokowe potencjały wywołane), które mogą wykryć zdolność komórek zwojowych siatkówki do wyzwalania się i wysyłania sygnałów do mózgu. Nagrania te wykazują głębokie defekty w miarę starzenia się zwierząt. Ponadto w laboratorium Michaela Do opracowano niezwykły test, w ramach którego można wyciąć siatkówkę wraz z przyczepionym do niej nerwem wzrokowym, przedstawić siatkówce precyzyjne wzory świetlne i zarejestrować wynikającą z tego aktywność elektryczną nerwu wzrokowego – w piękny, bezpośredni sposób. w celu zbadania funkcji populacji komórek zwojowych siatkówki. To ponownie sugeruje zmianę funkcji zmutowanej myszy R290Q i zaczyna ujawniać, gdzie następuje ta zmiana.
Czy możesz nam powiedzieć trochę więcej o tym, jak może to prowadzić do terapii ADOA?
Mając pod ręką nasze systemy modelowe, testujemy dwie strategie terapeutyczne. Jedną z nich jest terapia zastępcza genów. Mówiąc najprościej, jest to sposób na umieszczenie dobrej kopii OPA1 z powrotem w komórkach zwojowych siatkówki. Z jednej strony ADOA jest dobrym kandydatem do tego podejścia, ponieważ stosunkowo łatwo jest wprowadzić kopie genu do komórek zwojowych siatkówki poprzez wstrzyknięcie do ciała szklistego oka bezpiecznego, niereprodukującego się wirusa, w którym zachodzi ekspresja genu . Jest to forma terapii genowej zatwierdzona do stosowania klinicznego w siatkówce w leczeniu innych schorzeń. Co więcej, ponieważ degeneracja jest powolna, istnieje dobry moment, aby spróbować zakłócić degenerację poprzez dodanie dobrej próbki. Jest jednak problem – ludzkie białko OPA1 produkowane jest w 8 różnych wariantach (w procesie zwanym alternatywnym splicingiem RNA) i nie jest możliwe dodanie ich wszystkich z powrotem. Zastanawiamy się, czy dodanie tylko jednego z tych wariantów będzie wystarczające, a jeśli tak, to jakiego wariantu użyć.
Nasze drugie podejście polega na hamowaniu białka neuronalnego zwanego SARM1. SARM1 to enzym, który aktywuje się w zestresowanych lub uszkodzonych neuronach i powoduje ich obumieranie – wydaje się, że nie ma innego celu niż służenie jako przełącznik samobójstwa komórki. Wiele osób ze środowisk akademickich oraz firm farmaceutycznych i biotechnologicznych inwestuje czas i pieniądze w rozwój hamowania SARM1 jako strategii zapobiegania neurodegeneracji. Jeśli zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki w ADOA będzie przebiegać poprzez aktywację SARM1, pacjenci z ADOA mogą odnieść korzyści z tego rozwoju.
Czy spodziewa się Pan, że opracowywane leczenie będzie miało zastosowanie u szerszej grupy pacjentów z ADOA, czy też będzie specyficzne dla mutacji?
W przeciwieństwie do niektórych strategii opartych na CRISPR, które są ukierunkowane tylko na jedną konkretną mutację, zarówno przywrócenie działającej kopii OPA1, jak i zapobieganie aktywacji SARM1 powinny działać równie dobrze w przypadku większości, a być może wszystkich pacjentów z mutacjami OPA1. Wyjątkiem od podejścia opartego na wymianie genu mogą być poważne dominujące formy negatywne występujące w ADOA+; istniałby rodzaj konkurencji pomiędzy zmutowanymi kopiami a normalnymi kopiami, a dominująca negatywna mutacja nadal mogłaby powodować problemy. Drugim zastrzeżeniem jest to, że te strategie, jeśli zadziałają, będą stosunkowo łatwe do zastosowania w oku, ale terapia genowa jest trudniejsza w przypadku innych typów neuronów dotkniętych ADOA+.
Czy można zastosować połączenie obu podejść terapeutycznych, czy też należy skupić się na jednym lub drugim?
Mamy nadzieję, że przynajmniej jedna z tych strategii się opłaci. Jeśli obydwie metody działają, nie widzę powodu, dla którego strategie te, jeśli działają, nie miałyby zostać połączone, jeśli zwiększyłoby to ich skuteczność. Nie ma w nich nic a priori niezgodnego.
Na koniec chciałbym podkreślić, jak istotne było posiadanie zespołu doświadczonych współpracowników. W tym właśnie tkwi siła wielu osób – nikt z nas nie miałby odwagi podjąć się tego wyzwania bez naszej wspólnej wiedzy i żadne z nich nie odbyłoby się bez inicjatywy rodziny, która napędzała i wspierała projekt.
