Vägen till behandling 23
Intervju med Tom Schwarz från Harvard
Vi var i kontakt med Thomas Schwarz, som är professor i neurobiologi vid Harvard Medical School och professor i neurologi vid FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital. Thomas Schwarz och hans laboratorium är involverade i ADOA-forskning och utvecklar inte en, utan två potentiella behandlingar!
Kan du ge oss en inblick i hur du undersöker ADOA?
Jag kommer att svara genom att förklara vad teamet på Boston Children's Hospital har gjort angående ADOA och vad vi försöker göra genom att utveckla terapeutiska riktlinjer. Vårt arbete med ADOA växte fram ur samtal med en familj som hade ett mycket personligt intresse för denna sjukdom och var ivriga att främja och till och med sponsra forskning om ADOA. Här på Boston Children's Hospital finns en mycket stark grundläggande neurovetenskaplig gemenskap, inklusive flera forskare som studerar retinala ganglionceller, den celltyp som är mest benägen att degenerera i ADOA. Och det finns också mitt laboratorium, som länge har varit intresserad av neurala mitokondriers cellbiologi. Detta inkluderar mitokondrierna i retinala ganglionceller, som dör på grund av ADOA. Vi sammanställde därför ett samarbetskonsortium som inkluderade mitt laboratorium och Drs. Michael Do, Larry Benowitz och Chinfei Chen. Vi har också ett utmärkt pågående samarbete med Dr. Marni Falk och hennes kollegor vid Children's Hospital of Philadelphia (CHoP). Jag måste säga att det mesta av arbetet gjordes av en fantastisk postdoc i mitt labb, Dr. Chen Ding, PhD, med hjälp och vägledning från våra kollegor och kärnanläggningar här på Boston Children's.
Vår plan var att skapa en ny musmodell av ADOA som bar R290Q-mutationen som finns i flera familjer. Många ADOA-mutationer orsakar vad genetiker kallar "haploinsufficiens", vilket innebär att mutationen helt enkelt hindrar en av de två kopiorna av OPA1-genen från att göra ett funktionellt protein, och cellerna måste nöja sig med hälften av den mängd OPA1 som de normalt borde ha. . Andra ADOA-mutationer – särskilt de som faller i den del av OPA1 med enzymatisk aktivitet – är värre än att bara göra ett protein som inte fungerar. Istället gör de ett protein som aktivt kommer i vägen och hindrar den goda kopian av OPA1 från att också fungera. Dessa kallas "dominant negativa" mutationer, och patienter med dessa mutationer kallas ibland ADOA+-patienter. R290Q-mutationen sitter precis vid kanten av denna enzymatiska del, så vi visste inte om det skulle vara en enkel mutation med förlorad funktion eller en dominant negativ, men vi hoppades att den skulle ge en tillräckligt stark fenotyp i musen som vi skulle kunna använda den för att studera degenerationen av retinala ganglionceller.
Hur lyckades du förändra musens gener, vilken teknik använde du?
Vi använde CRISPR-teknik för att introducera denna R290Q-mutation – vilket visade sig vara förvånansvärt svårt! Vi tror att detta beror på att CRISPR-metoden fungerade för bra och muterade båda kopiorna av OPA1-genen – och celler med båda kopiorna muterade kommer inte att producera en livskraftig mus. Men så småningom lyckades vi skapa R290Q-mutantmuslinjen och har studerat den musen under de senaste 2 åren. Vi fick också från CHoP en stamcellinje som kommer från en patient och har samma mutation – och en kontrollgrupp med den mutationen korrigerad med CRISPR. Det betyder att vi kan utföra experiment parallellt i musmodellen och i mänskliga neuroner som vi kan generera från de stamcellerna. Arbetet med R290Q-musen går bra. OPA1-genens normala funktioner inkluderar att låta de inre membranen i mitokondrierna smälta samman när två mitokondrier möts. I friska celler, inklusive friska neuroner, smälts många mitokondrier samman till ett nätverk. Men i neuroner från R290Q-musen är mitokondrierna fragmenterade, som förväntat med en OPA1-mutation. Näthinnan hos dessa möss är förvånansvärt normala och funktionella när mössen är unga, men när de åldras ser vi många defekter som är parallella med de som ses hos ADOA-patienter. Kom ihåg att förlusten av retinala ganglionceller hos ADOA-patienter kan ta årtionden, men möss lever vanligtvis i cirka 2 år. Så vi har tur att vi i vår musmodell kan se att några av dessa retinala ganglionceller dör efter bara 9 – 12 månader.
Hos friska möss finns det ett normalt isolerande lager runt axonerna (den långa delen av synnerven som överför information till hjärnan) hos retinala ganglieceller. R290Q-musen visar också demyelinisering av nervfibrer (axoner) i synnerven – med andra ord en förlust av det normala isoleringsskiktet som hjälper till med nervledning i den del av retinala gangliecellerna som transporterar signaler från ögat till hjärnan . Vi gör även elektrofysiologiska inspelningar (elektroretinogram och visual evoked potentials) som kan upptäcka retinala gangliecellers förmåga att skjuta och skicka signaler till hjärnan. Dessa inspelningar visar djupa defekter när djuren åldras. Dessutom har Michael Dos laboratorium etablerat en anmärkningsvärd analys där de kan skära ut näthinnan med synnerven fäst vid den, presentera exakta ljusmönster på näthinnan och registrera den resulterande elektriska aktiviteten i synnerven – ett vackert direkt sätt att undersöka funktionen hos populationer av retinala ganglieceller. Detta tyder återigen på en förändring i funktion i R290Q-mutantmusen och börjar avslöja var den förändringen sker.
Kan du berätta lite mer om hur detta kan leda till en behandling för ADOA?
Med våra modellsystem till hands testar vi två terapeutiska strategier. En av dem är genersättningsterapi. Enkelt uttryckt är detta ett sätt att sätta tillbaka en bra kopia av OPA1 i retinala ganglioncellerna. Å ena sidan är ADOA en bra kandidat för detta tillvägagångssätt eftersom det är relativt lätt att få in kopior av en gen i retinala ganglionceller genom injektion i glaskroppen i ögat, med ett säkert, icke-reproducerande virus som uttrycker genen . Detta är en form av genterapi godkänd för klinisk användning i näthinnan för andra tillstånd. Dessutom, eftersom degenerationen är långsam, finns det ett bra tidsfönster för att försöka störa degenerationen genom att lägga till det goda provet. Men det finns ett problem – det mänskliga OPA1-proteinet tillverkas i 8 olika varianter (genom en process som kallas alternativ RNA-skarvning) och det är inte möjligt att lägga till dem alla igen. Vi funderar på om det räcker med att lägga till bara en av dessa varianter och i så fall vilken variant vi ska använda.
Vår andra metod är att hämma ett neuronalt protein som heter SARM1. SARM1 är ett enzym som aktiveras i stressade eller skadade neuroner och får neuroner att dö - det verkar inte ha något annat syfte än att fungera som en cellsjälvmordsomkopplare. Många människor inom den akademiska världen och i läkemedels- och bioteknikföretag investerar tid och pengar på att utveckla SARM1-hämning som en strategi för att förhindra neurodegeneration. Om degenereringen av retinala ganglionceller i ADOA fortsätter genom att aktivera SARM1, kan ADOA-patienter dra nytta av denna utveckling.
Förväntar du dig att behandlingen under utveckling är tillämpbar på en bredare grupp av ADOA-patienter eller kommer den att vara mutationsspecifik?
Till skillnad från vissa CRISPR-baserade strategier som bara riktar sig till en specifik mutation, bör både återställa en arbetskopia av OPA1 och förhindra SARM1-aktivering fungera lika bra för de flesta, kanske alla, patienter som har OPA1-mutationer. Undantaget från genersättningsmetoden kan vara i de allvarligt dominerande negativa former som finns i ADOA+; det skulle finnas någon form av konkurrens mellan de muterade kopiorna och de normala kopiorna och den dominerande negativa mutationen kan fortfarande orsaka problem. Den andra varningen är att dessa strategier, om de fungerar, skulle vara relativt lätta att tillämpa i ögat, men genterapi är svårare för de andra typerna av neuroner som påverkas i ADOA+.
Skulle de två terapeutiska tillvägagångssätten kunna användas i kombination, eller skulle fokus ligga på det ena eller det andra?
Vi hoppas att åtminstone en av dessa strategier kommer att löna sig. Om de båda fungerar ser jag ingen anledning till att strategierna, om de fungerar, inte skulle kunna kombineras om det skulle öka deras effektivitet. Det finns inget a priori oförenligt med dem.
Slutligen vill jag betona hur avgörande det har varit att ha ett team av expertsamarbetare. Detta är styrkan hos många – ingen av oss skulle ha haft modet att anta denna utmaning utan vår samlade expertis och inget av det skulle ha hänt utan initiativet från familjen som drev och stöttade projektet.
